一 摘要：

　　1.1 实验内容：

　　厌氧菌的分离、培养及鉴定;

　　1.2 目的：

　　1 掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。

　　了解厌氧菌菌鉴定的一般方法。

　　2 复习并巩固平时所学的微生物知识与技能。

　　3 培养独立思考、设计和动手实验的能力。

　　二 介绍：

　　厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。

　　专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

　　厌氧菌的培养：

　　在培养厌氧菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0,O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。所以说，要保证厌氧菌培养时的低电位是很重要的。

　　厌氧菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术 因此他是世界上第一个分离纯化厌氧菌的人。

　　以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验;任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。

　　三 实验材料与设备：

　　3.1 分离与培养：

　　3.1.1菌种：待测样品;

　　3.1.2 培养基：改良的PRAS培养基(氮素自加)

　　[配方组成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸钠5g,乙酸钠5g,甲醇3.5ml,Ph值为7.0,蒸馏水1000ml,1%的树脂刃天青(还原指示剂)1ml,121摄氏度灭菌20min.使用前每5ml培养基加入1%Na2S(还原剂)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制剂)各0.1ml]

　　3.1.3 试剂：冰块 Na2S NaHCO3

　　3.1.4 器材：高纯氮气 厌氧管 厌氧手套箱 注射器 恒温培养箱 铜柱除氧系统 定量加样器 厌氧罐 超声波破碎仪 酒精灯 冰块 水浴锅 记号笔 振荡器 等

　　3.2 菌种的鉴定：

　　3.2.1 菌种：待测菌

　　3.2.2 培养基;糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基(液体);

　　3.2.3 试剂;乙醚 吲哚试剂 卢戈氏碘液;

　　3.2.4 器材：超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 接种环 移液管载玻片 显微镜 等

　　四、实验方法与步骤：

　　4.1分离与培养

　　4.1.1 铜柱系统除氧

　　铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。

　　4.1.2 预还原培养基及稀释液的制备

　　在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。

　　4.1.3 分离

　　(1)编号

　　取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

　　(2)稀释

　　在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。

　　(3)滚管分离

　　1)滚管

　　将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

　　2)分离纯化

　　生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

　　3)划线分离

　　将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。

　　4.1.4 镜检与计数

　　(1)镜检

　　挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

　　(2)计数

　　液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有厌氧菌数量cfu/g(mL)样品=A×10ml×X/10×D

　　A-0.1mL滚管计数的实际平均值;

　　X- 镜检呈现为厌氧菌的数目;

　　X/10-菌落中厌氧菌的概率;

　　D- 稀释倍数

　　4.2 菌种的鉴定

　　4.2.1糖发酵试验

　　糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

　　具体实验步骤：

　　① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。

　　4.2.2 蛋白质分解实验

　　① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。

　　4.2.3 淀粉水解实验

　　① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

　　② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

　　③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。

　　五 注意事项及注释：

　　1 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。

　　2 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。

　　3 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。

　　4树脂刃天青(resazurin)既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色(培养基的颜色)，它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。

　　5培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为厌氧菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。

　　6注射器在使用前必须先用培养基上面的气体冲洗、填充，然后插入培养基的下层，以保证当培养基移入试管时，就处于无氧气体层的下面。